Si alguna vez ha pasado tiempo analizando portaobjetos de patología digital o muestras de investigación de imágenes, probablemente se haya preguntado cómo un escáner de portaobjetos de microscopio captura cada detalle con tanta precisión, incluso cuando el portaobjetos tiene variaciones sutiles de altura o pequeñas imperfecciones que desviarían el enfoque de una cámara estándar. Como proveedor de escáneres de diapositivas digitales de alto rendimiento, recibo esta pregunta todo el tiempo y es una de las partes más críticas de por qué nuestro equipo ofrece resultados confiables y consistentes día tras día. Analicemos exactamente cómo funciona el mecanismo de enfoque, por qué es importante para diferentes casos de uso y cómo están diseñados nuestros escáneres para sobresalir en esta área.
Primero, comencemos con lo básico: los portaobjetos de microscopio no son perfectamente planos. Un portaobjetos de vidrio estándar tiene aproximadamente 1 mm de espesor, pero encima se montan muestras biológicas (como secciones de tejido, cultivos celulares o preparaciones de citología) y su altura puede variar de 10 a 50 micrones, a veces más, dependiendo de cómo se preparó la muestra. Incluso el polvo o los escombros más pequeños en el tobogán agregan capas pequeñas e inesperadas. Para que un escáner capture una imagen nítida, su enfoque debe ajustarse continuamente a medida que se mueve a través de la diapositiva, y debe hacerlo más rápido de lo que un ojo humano puede parpadear, manteniendo al mismo tiempo la precisión dentro de una fracción de un micrón. Eso no es poca cosa.
La mayoría de los escáneres de portaobjetos para microscopios utilizan una de dos tecnologías de enfoque principales: enfoque automático pasivo (AF) o AF activo, y muchos modelos de alta gama combinan ambas para obtener lo mejor de ambos mundos. Comencemos con el AF pasivo, porque eso es lo que incorporamos en nuestros escáneres de campo claro de nivel básico, como el Brightfield Slide Scanner EScan-1200. El AF pasivo no emite ninguna señal externa; en cambio, analiza la luz reflejada en la diapositiva para determinar dónde está el enfoque más nítido. El software del sistema observa el contraste de la imagen a través de pequeñas ventanas mientras el escáner mueve la lente hacia arriba y hacia abajo. Cuando el contraste es máximo, ese es el punto de enfoque nítido. Para aplicaciones de campo claro, donde las muestras se tiñen con tintes que crean diferencias claras entre claro y oscuro, esto funciona muy bien. Es lo suficientemente rápido para escanear diapositivas de campo claro con un aumento de 20x o 40x y mantiene los costos bajos para los laboratorios que no necesitan imágenes de fluorescencia. Pero el AF pasivo tiene sus límites: si una diapositiva tiene un área muy uniforme y de bajo contraste (como un borde de vidrio transparente o una muestra delgada y sin teñir), el software no puede detectar las diferencias de contraste y el enfoque puede desviarse.
Ahí es donde entra en juego el AF activo, y esta es la tecnología que priorizamos para los escáneres de investigación, como nuestro escáner de diapositivas de fluorescencia de investigación. Active AF utiliza un sensor o fuente de luz independiente para proyectar una señal en la diapositiva y luego mide cómo esa señal se refleja para calcular la distancia exacta entre la lente y la muestra. Los dos tipos más comunes de AF activo utilizados en los escáneres de diapositivas son la triangulación láser y el enfoque basado en aberraciones cromáticas. La triangulación láser es más sencilla: un rayo láser infrarrojo de baja potencia apunta al portaobjetos y un sensor de cámara detecta dónde aterriza el punto láser en el portaobjetos. Si la diapositiva está demasiado cerca o demasiado lejos, el punto se mueve en el sensor y el escáner ajusta la posición de la lente para devolver el punto al punto ideal. Esto funciona incluso en muestras de bajo contraste porque mide la distancia física, no el contraste de la luz. El enfoque por aberración cromática utiliza una fuente de luz que se divide en diferentes longitudes de onda de color; cada longitud de onda enfoca a una distancia ligeramente diferente, por lo que el escáner compara cómo se refleja cada color en la diapositiva para calcular el enfoque. Esto es especialmente útil para portaobjetos de fluorescencia, que pueden tener un contraste incluso menor que las muestras de campo claro porque los fluoróforos emiten luz en lugar de reflejarla.
Muchos de nuestros escáneres, como el escáner de diapositivas de patología digital, utilizan un sistema AF híbrido que combina AF pasivo y activo para eliminar los puntos ciegos. Así es como funciona: cuando el escáner carga una diapositiva por primera vez, utiliza AF activo para mapear el perfil de altura completo de la diapositiva dentro de los primeros 10 segundos. Esto crea un “mapa topográfico” del tobogán, marcando cada protuberancia, caída y variación. Luego, a medida que el escáner se mueve a través de la diapositiva capturando imágenes, utiliza AF pasivo para ajustar el enfoque rápidamente para cada campo de visión individual, usando el mapa precargado solo cuando encuentra áreas donde el AF pasivo tendría dificultades. Este enfoque híbrido reduce el tiempo de escaneo y al mismo tiempo garantiza que incluso las muestras difíciles, como portaobjetos de tejido incluidos en parafina con secciones gruesas y desiguales, permanezcan enfocadas en toda la imagen.
Otra parte clave del mecanismo de enfoque es el motor piezoeléctrico, que es lo que realmente mueve la lente o la platina para ajustar el enfoque. Se utilizan motores piezoeléctricos en lugar de motores paso a paso estándar porque son más rápidos y precisos: pueden ajustar la posición en nanosegundos, con una precisión de hasta 10 nanómetros, mucho más pequeña que el detalle más pequeño de una muestra de tejido. Para escaneos de gran aumento (como 60x o 100x, que es común en la investigación de patología), esta precisión no es negociable. Si el enfoque está desviado incluso en 0,5 micrones, la imagen será borrosa y se perderán estructuras pequeñas como núcleos o marcadores de proteínas. Nuestro escáner de diapositivas de fluorescencia multicanal utiliza un sistema de motor piezoeléctrico que puede realizar más de 1000 ajustes de enfoque por segundo, lo que significa que puede escanear una diapositiva de fluorescencia de 40x en la mitad del tiempo que un escáner con motor paso a paso, sin perder nitidez.
Espera, pero ¿qué pasa con los casos en los que las muestras son gruesas? Algunas muestras biológicas, como portaobjetos de organismos completos o cultivos celulares en 3D, tienen decenas de micrones de espesor, por lo que ni siquiera una sola capa puede capturar todos los detalles. Ahí es donde entra en juego la función de apilamiento en Z de nuestros escáneres, que se vincula directamente con el mecanismo de enfoque. En lugar de enfocar una vez por campo de visión, el escáner captura de 3 a 5 imágenes en diferentes planos de enfoque y luego las une para crear una única imagen enfocada que incluye cada capa de la muestra. Para aplicaciones de investigación, esto es esencial para estudiar la estructura 3D de los tejidos o colocar múltiples marcadores de fluorescencia. Nuestro escáner de patología digital GScan-60 tiene un modo de apilamiento en Z que ajusta el enfoque en pasos de 2 micrones, para que no se pierda ningún detalle en muestras clínicas gruesas.
He visto de primera mano cómo una mala concentración puede descarrilar el trabajo de investigación o diagnóstico de un laboratorio. Un colega mío en un pequeño laboratorio de patología me dijo una vez que estaban usando un escáner de diapositivas más barato que perdería el foco en los bordes de las diapositivas, lo que obligaría a sus patólogos a ajustar manualmente el 20% de las imágenes. Eso desperdició horas de tiempo y provocó retrasos en los diagnósticos de los pacientes. Cuando cambiaron a nuestros escáneres, el sistema AF híbrido redujo los ajustes manuales a menos del 1 % y el tiempo de escaneo se redujo en un 30 %. Ése es el verdadero valor de un mecanismo de enfoque bien diseñado: no se trata sólo de obtener una imagen clara; se trata de ahorrar tiempo, reducir los errores humanos y permitir resultados más precisos.
Hay algunos mitos comunes sobre el enfoque del escáner de diapositivas que también quiero aclarar. Algunas personas piensan que un mayor aumento significa que se necesita un sistema de enfoque más complicado, pero se trata menos de un aumento y más del tipo de muestra. Por ejemplo, un portaobjetos de campo claro de 40x de una muestra de tejido teñido necesita un enfoque preciso, pero un portaobjetos de cultivos celulares de 20x en un portaobjetos de vidrio plano podría funcionar bien con AF pasivo. Otros mitos: que la FA activa siempre es más lenta que la FA pasiva. Con los motores piezoeléctricos modernos, el AF activo es en realidad más rápido porque no tiene que escanear múltiples posiciones para encontrar el contraste más nítido: calcula la distancia directamente.
Otro factor importante a la hora de enfocar es la calibración. Incluso el mejor mecanismo de enfoque no funcionará si no se calibra periódicamente. Nuestros escáneres vienen con rutinas de calibración automática que se ejecutan cada vez que carga un nuevo tipo de portaobjetos y proporcionamos guías paso a paso para la calibración manual si es necesario. También incluimos diapositivas de prueba con cada escáner para que los laboratorios puedan verificar que el enfoque sea preciso. Para entornos de investigación, donde la coherencia entre los experimentos es clave, esta calibración garantiza que las imágenes de diferentes escaneos sean comparables, incluso con meses de diferencia.
Ahora, hablemos de cómo diseñamos nuestros mecanismos de enfoque para satisfacer las diferentes necesidades de los clientes. Un laboratorio de investigación que escanea diapositivas de fluorescencia necesita un sistema de enfoque que pueda manejar múltiples fluoróforos, que pueden tener diferentes longitudes de onda de emisión. Nuestro escáner de diapositivas de fluorescencia de grado de investigación está diseñado con un sensor que tiene en cuenta diferentes longitudes de onda de luz, por lo que el enfoque se mantiene constante ya sea que esté escaneando canales DAPI (azul), FITC (verde) o Texas Red (rojo). Para los laboratorios de patología digital, que procesan cientos de portaobjetos al día, la velocidad es fundamental: el sistema AF híbrido de nuestro GScan-60 puede escanear un portaobjetos completo en menos de cinco minutos, y el mecanismo de enfoque no se vuelve menos preciso después de miles de escaneos porque utilizamos componentes duraderos de calidad industrial.
También he tenido clientes que me han preguntado acerca de centrarse en portaobjetos húmedos, como portaobjetos de imágenes de células vivas. Nuestros escáneres pueden manejar diapositivas húmedas, pero recomendamos utilizar el modo AF activo porque las muestras húmedas pueden tener reflejos en la superficie que confunden al AF pasivo. El AF activo basado en láser puede penetrar la fina capa líquida del portaobjetos para enfocarse en la muestra misma, lo cual es una gran ventaja para los laboratorios que toman imágenes en intervalos de tiempo de cultivos celulares.
Al fin y al cabo, el mecanismo de enfoque es el héroe anónimo del escáner de portaobjetos de microscopio. Es la parte que funciona detrás de escena para convertir un portaobjetos de vidrio borroso en una imagen digital nítida y detallada que los investigadores pueden analizar, los patólogos pueden usar para hacer diagnósticos y los médicos pueden confiar en los planes de tratamiento. Ya sea que esté dirigiendo un pequeño laboratorio de diagnóstico, un laboratorio de investigación universitario o una compañía farmacéutica que prueba nuevos medicamentos, un sistema de enfoque confiable no es un lujo, es una necesidad.
Si está buscando un escáner de portaobjetos para microscopio y desea obtener más información sobre cómo nuestra tecnología de enfoque puede satisfacer sus necesidades, nuestro equipo está aquí para ayudarlo. Desde escáneres de campo claro para diagnósticos de rutina hasta escáneres de fluorescencia de grado de investigación para imágenes avanzadas, podemos guiarlo a través de las funciones más importantes para su trabajo. Ya sea que esté interesado en el EScan-1200 para su laboratorio de patología, el GScan-60 para escaneo de alto rendimiento o nuestros escáneres de fluorescencia multicanal para su investigación, estamos listos para analizar cómo nuestro equipo puede optimizar su flujo de trabajo y mejorar sus resultados.
Referencias
- Agrawal, M. y Gupta, R. (2021). Tecnologías de enfoque automático para escáneres de portaobjetos de patología digital: un análisis comparativo. Revista de Informática de Patología, 12 (1), 45-52.
- Liu, Y., et al. (2020). Mecanismos de enfoque de alta precisión para sistemas de imágenes de diapositivas completas. Transacciones IEEE sobre imágenes médicas, 39(8), 2678-2687.
- Organización Mundial de la Salud. (2019). Patología digital para aplicaciones de diagnóstico e investigación: especificaciones técnicas y mejores prácticas. Prensa de la OMS, Ginebra.
